Ali ste kdaj s prstom pokazali na drage reagente ali zapletene instrumente, ko poskus ne uspe? Toda včasih se lahko pravi "krivec" tiho skriva v kotu - tista na videz navadna steklenička puferskega reagenta. Čeprav je neopazen, je rešilna bilka za ohranjanje natančnosti eksperimenta. Danes bomo razkrili skrivnost tega "nevidnega varuha".
Ⅰ. Medpomnilnik: kaj je to? Zakaj je nepogrešljiv v laboratoriju?
Preprosto povedano, pufer je poseben sistem raztopine, ki se lahko upre učinkom majhne količine dodane kisline, alkalije ali razredčitve in vzdržuje razmeroma stabilno pH vrednost raztopine. Običajno je sestavljen iz para "partnerjev" - šibke kisline in njene konjugirane baze (ali šibke baze in njene konjugirane kisline), kot je ocetna kislina/natrijev acetat (HAc/Ac-), natrijev dihidrogenfosfat/dinatrijev hidrogenfosfat (NaH₂PO₄/Na₂HPO₄) itd., ki so običajni v laboratorijih.
Osnovna sposobnost: Stabilizira pH in se upira spremembam!
Ko v poskus po nesreči vnesemo majhno količino kislih ali alkalnih snovi, bo »partner« v pufru hitro reagiral, kot učinkovit »vratar vodikovih ionov«, jo absorbiral ali sprostil in se tako izognil drastičnemu nihanju pH vrednosti raztopine. Ta sposobnost je bistvena za številne biokemične reakcije, ki so odvisne od specifičnega pH okolja.
Ⅱ. Laboratorijski oder: nepogrešljiva protagonistka in stranska vloga
1. "Sistem za vzdrževanje življenja" biokemičnih poskusov:
Raziskave encimske aktivnosti:Večina encimov ima optimalno aktivnost le v ozkem pH območju. Pufri (kot je Tris-HCl, PBS) zagotavljajo stabilno "delovno mizo" za encimske reakcije, ki zagotavljajo zanesljive rezultate.
Čiščenje in analiza beljakovin:Od celične lize, kromatografskega ločevanja (ionska izmenjava, afinitetna kromatografija) do elektroforeze (kot je SDS-PAGE), kristalizacije in shranjevanja beljakovin, vsak korak zahteva pufer s specifičnim pH, da ohrani strukturo, naboj in topnost beljakovine ter prepreči denaturacijo ali obarjanje.
Manipulacija z nukleinsko kislino:PCR reakcija, ekstrakcija DNA/RNA, encimska razgradnja, ligacija, hibridizacija in drugi procesi so izjemno občutljivi na pH. Običajno uporabljeni pufri, kot je TE (Tris-EDTA), lahko stabilizirajo strukturo nukleinskih kislin in jih zaščitijo pred razgradnjo nukleaze.
2. "Uspavanka" celične kulture:Gojišče celične kulture (kot je DMEM, RPMI) je samo po sebi kompleksen puferski sistem (pogosto temelji na sistemu natrijevega bikarbonata/ogljikovega dioksida). Dodajanje dodatnih pufrov (kot je HEPES) lahko zagotovi celicam stabilnejši pH okolje, zlasti pri menjavi tekočin, opazovanju ali kadar lahko koncentracije ogljikovega dioksida nihajo, da se zagotovi zdrava rast celic.
3. "Stabilizacijska sila" analitične kemije:
Kromatografsko ločevanje:Pri tekočinski kromatografiji visoke ločljivosti (HPLC) in ionski kromatografiji (IC) je pH mobilne faze ključni kontrolni parameter za učinek ločevanja, pufri (kot so fosfati in acetati) pa zagotavljajo ponovljivost postopka ločevanja.
Titracijska analiza:Nekatere reakcije titracije je treba izvajati pri konstantnem pH ali navesti končno točko, ko je dosežen določen pH, pufer pa ima stabilizacijsko vlogo.
Priprava standardnih raztopin:Vrednost pH mnogih standardnih raztopin je treba natančno nadzorovati, osnova pa so pufri.
Ⅲ. Izbira in uporaba: veliko znanja
Izberite pravi vmesni sistem:
Vrednost pKa je ključna:Učinkovito območje pufra pufra je običajno v območju njegove vrednosti pKa ± 1. Bodite prepričani, da izberete pufer z vrednostjo pKa blizu delovnega pH, ki ga potrebujete! Na primer, fosfat (pKa ~ 7,2) se pogosto uporablja v nevtralnem območju pH, Tris (pKa ~ 8,1) pa se pogosto uporablja v alkalnem območju.
Združljivost:Razmislite, ali komponente pufra motijo vašo eksperimentalno reakcijo (npr. fosfat lahko moti nekatere študije fosforilacije, borat pa lahko reagira s sladkorji).
Ionska moč in temperatura:Ionska moč vpliva na aktivnost encimov, topnost itd.; temperaturne spremembe lahko pomembno vplivajo na vrednost pKa pufrov, kot je Tris (Tris ima velik temperaturni koeficient pKa približno -0,031/ stopinjo).
Ⅳ. Seznam skupnih medpomnilnikov
1. Serija pufra PBS
PBS pufer 1 × (pH 7,4), PBS pufer 10 × (pH 7,4), PBS fosfatni prašek (brez kalcijevih in magnezijevih ionov): pranje celic v poskusih celične kulture (na primer pred menjavo gojišča); redčenje protiteles in pranje ELISA plošč v imunoloških poskusih; vzdrževanje osmotskega tlaka in stabilnosti pH v poskusih z beljakovinami/nukleinsko kislino itd.
DPBS pufer (brez kalcija in magnezija), DPBS fosfatni prašek (brez kalcijevih in magnezijevih ionov): pretočna citometrija v celičnih poskusih, izpiranje po prebavi celic (da preprečimo, da bi kalcij in magnezij vplivala na aktivnost encimov); redčenje encimov ali izvajanje ionsko{0}}občutljivih eksperimentov v molekularni biologiji (kot so določene reakcije PCR) itd.
Pufer PBST (1×), pufer PBST (10×): uporablja se za korake blokiranja in izpiranja pri Western Blotu ali imunohistokemiji, zmanjšanje nespecifične vezave itd.
2. Serija medpomnilnikov TBS
TBS pufer (1×), TBS pufer (10×): zamenjajte PBS pufer v imunoloških poskusih (da se izognete interferenci fosfata z določeno vezavo protiteles); stabilizirajo alkalno pH okolje v beljakovinskih poskusih itd.
3. Serija pufrov HBSS
Pufer HBSS (brez kalcija in magnezija, brez fenol rdečega)/Hankov pufer (brez kalcija in magnezija): ločevanje celic in centrifugalno pranje v celičnih poskusih (kot je pretočna citometrija); kratkoročno- vzdrževanje celic (kot je slikanje celic v živo) itd. Pufer HBSS (brez kalcija in magnezija, brez fenol rdečega): vzdržuje presnovno aktivnost celic v celični kulturi (kalcij in magnezij sodelujeta pri prenosu signala); poskusi celične migracije/invazije.
4. Serija pufra TE
TE pufer (1×), TE pufer (10×): raztapljanje in shranjevanje DNA/RNA (Tris vzdržuje pH, EDTA kelatira kovinske ione, da zavira aktivnost nukleaze); razredčeno DNK za PCR, sekvenciranje in druge poskuse.
5. Serija pufrov za elektroforezo
TAE pufer (1×): običajna elektroforeza v DNA agaroznem gelu (nizka ločljivost, primerna za velike fragmente DNA). TBE pufer (1×), TBE pufer (10×): elektroforeza DNA/RNA z visoko-ločljivostjo (kot je elektroforeza z majhnimi fragmenti ali poliakrilamidnim gelom); dolgotrajna-elektroforeza (puferska zmogljivost je boljša od TAE).
6. Western Blot Experiment Buffer Series
Pufer za prenos Western Blot (10×): Pufer, ki se uporablja za prenos proteinov iz gela na membrano (kot je membrana PVDF), ki vsebuje Tris, glicin in metanol.
Tris-HCl pufer (1mol/L, pH6,8): Priprava koncentriranega gela SDS-PAGE itd.
Tris-HCl pufer (1,5 mol/L, pH8,8): Priprava SDS-PAGE ločevalnega gela itd.
7. Serija standardnih pH pufrov
pH=4.00/6,86/9,18 pufer (pripravljen 250 ml): standardna raztopina za umerjanje pH metra (npr. pH6,86 je nevtralen standard, pH4,00 in 9,18 sta kisla in alkalna standarda).
Puferski reagenti nikakor niso osnovna podporna vloga v laboratoriju. Njihova glavna vrednost je zagotavljanje natančnega in stabilnega protonskega okolja, ki je temelj za vzdrževanje termodinamičnega ravnovesja in kinetične hitrosti večine biokemičnih reakcij. Od regulacije mikrookolja encimskih aktivnih mest do zagotavljanja konformacijske stabilnosti biomakromolekul do vzdrževanja transmembranskih ionskih gradientov je pH puferska zmogljivost puferskega sistema nepogrešljiv predpogoj za ponovljivost in zanesljivost eksperimentalnih podatkov. Beekman vas bo spremljal na vaši znanstvenoraziskovalni poti.
Hunan BKMAM Holding Co., Ltd
Spletna stran: www.bkmbio.com
E-pošta:info@bkmbio.com
